北京大学夏青教授课题组完成对科兴新冠疫苗的人免疫细胞功能及组学评价

        2021年2月9日，北京大学药学院夏青教授课题组在Lancet预印本上发表题为“Single-Cell Sequencing and Immune Function Assays of Peripheral Blood Samples Demonstrate Positive Responses of an Inactivated SARS-CoV-2 Vaccine”的文章（DOI: 10.2139/ssrn.3774153）。该研究全面解析了13个受试者接种北京科兴中维新冠灭活疫苗克尔来福（CoronaVac）前后的不同时间点（Day 0, Day 14, Day 28, Day 35, Day 45）及12个恢复期病例（Month 8）的外周血单个核细胞（PBMC）组分的变化，疫苗体外刺激T细胞的细胞因子的变化，及多组学分析了基因水平（单细胞测序和PacBio测序）、蛋白水平（~5000种血清蛋白质组学）、脂质水平（~3000种血浆脂质组学）和代谢水平（~20000种血浆代谢组学）的变化（图1）。此研究从多角度详细解析了CoronaVac接种后的免疫特征及免疫分子机制，补充了CoronaVac在临床上研究结果。这是迄今为止对灭活病毒疫苗最全面的功能解析。

图1. 实验设计流程示意图

        该研究共招募了13名新冠疫苗受试者和12名新冠肺炎康复者（8个月）。疫苗组受试者接种两剂CoronaVac（分别在Day 0和Day 28接种），两次接种的间隔为28天，并在接种前后（Day 0, Day 14, Day 28, Day 35）对受试者进行取样，分离外周血单个核细胞，然后进行多项免疫功能和组学检测，比较接种疫苗前后与康复组的各项指标变化（图2）。

图2. 总体实验设计方案及招募者信息

首先，研究者使用流式细胞术来检测相应免疫细胞亚群的含量，发现CD1c+ mDC细胞比例在一次免疫后呈显著上升趋势，其在初级免疫反应的启动和形成过程中起着中心作用。外周血中总Tfh细胞，Th1-样Tfh细胞，循环记忆Tfh细胞，Th17细胞在新冠疫苗刺激早期（<35天）呈显著上升趋势，Th2-样Tfh细胞在一次注射后显著上升，14天到达峰值，随后呈下降趋势，诱导记忆B细胞的辅助Tfh细胞在35天及以后，呈显著上升趋势。一次免疫以后，循环记忆B细胞和浆母细胞显著上调。研究者从受试者血液中分离出CD4+T细胞，然后在体外用新冠疫苗刺激CD4+T细胞后，检测了12种细胞因子的释放。第1型辅助性T细胞（Th1）细胞因子例如IFN-γ和IL-2主要在第14天、第28天和第35天激活，支持早期主要为细胞免疫反应。第2型辅助性T细胞（Th2）细胞因子例如IL-4、IL-6、IL-10，主要在第28天、第35天和第45天活化，支持后期主要为体液免疫反应，尤其是在第二次免疫后。其他细胞因子，如TNF-α、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17a、IL-17f和IL-22，刺激后无显著差异，表明疫苗不会引起相关的副作用（图3）。

图3 新冠疫苗刺激体外CD4+T细胞后的细胞因子释放实验

        其次，研究者通过设定Gene Marker对单细胞测序中的PBMC细胞类型进行分群，初步分为B细胞、T细胞、NK细胞和Myeloid细胞，发现接种新冠疫苗后Day 14→Day 28→Day 35这一过程中，PBMC转录组学逐渐向康复组偏移，这些时间点都与未接种疫苗时Day00有较大差别，证明接种第一针新冠疫苗后两周（Day 14）即可改变受试者的PBMC转录组学，而于Day 28接种第二针新冠疫苗之后，健康受试者的PBMC转录组学即可达到与新冠康复者相似的免疫状态（图4）。

图4  PBMC单细胞测序中的免疫细胞亚群和百分比

研究者进一步对单细胞测序中各细胞亚群进行了差异基因表达分析，发现接种疫苗前后B细胞中的差异表达基因有33条，接种疫苗前与康复者的差异表达基因有62条，而共同差异基因却占了23条，这些共同差异基因中有8个属于同一通路（JUN/FOS通路），这证明接种科兴中维新冠疫苗可以诱导B细胞产生类似于新冠康复者的基因表达变化。如果对比接种疫苗后和康复者的B细胞，则只有很少的差异基因（13条），同样证明接种CoronaVac可以诱导B细胞至新冠康复期类似的状态（图5a-d）。

血清中和抗体水平是评价病毒疫苗的重要指标。研究者检测了同批次的抗体水平，发现接种第一针新冠疫苗后，血清中和抗体的水平并不是很高（Day14和Day28），但于Day28接种第二针新冠疫苗之后，血清中和抗体的上升幅度有显著上升（Day35和Day45），证明接种疫苗确实有效。通过对比血清中和抗体实验和PBMC单细胞测序实验，发现在接种第一针新冠疫苗后的两周（Day14），中和抗体的浓度还很低，但外周血单个核细胞转录水平已检测出较大变化，提示PBMC单细胞测序是一种较为灵敏的评价方法（图5e）。

图5  B细胞基因表达与血清中和抗体水平

该研究利用单细胞测序技术研究接种新冠疫苗前后PBMC的转录组学变化，如图5所示， f图表明接种疫苗前后的PBMC转录组学有显著不同，g图提示受试者接种新冠疫苗之前PBMC转录组学与康复组有显著不同，h图表示受试者接种新冠疫苗之后PBMC转录组学与康复组表达类似。有文献报道新冠康复者对新冠病毒的免疫记忆可达八个月以上，提示接种的科兴新冠灭活疫苗已经起效，可改变外周血单个核细胞的转录水平表达以对抗新冠病毒（图6）。

图6  接种疫苗前后及新冠康复者的PBMC单细胞测序分析

    最后，研究者还对疫苗受试者血液样本及恢复期病例样本进行血清蛋白质组学、血浆脂质组学、血浆代谢组学等研究。根据结果显示，接种新冠疫苗后血清/血浆在蛋白质组学、脂质组学、代谢组学的局部方面表现出与康复组接近的趋势，并进一步进行多组学相关分析（图7）。

图7. 新冠疫苗接种后血浆/血清的多组学分析

    综上，该研究首次全面解析了新冠灭活疫苗CoronaVac接种后的免疫特征和免疫分子机制。该研究的部分结果已于2021年2月9日在SSRN预印本网站以Preprints with THE LANCET发表。

原文链接：https://papers.ssrn.com/sol3/papers.cfm?abstract_id=3774153